丙酮酸脫氫酶(PDH)試劑盒,微板法

丙酮酸脫氫酶(PDH)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 丙酮酸脫氫酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS6380W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 丙酮酸脫氫酶（PDH，EC 1.2.4.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接 起來(lái)。 丙酮酸脫氫酶（PDH）催化底物丙酮酸鈉生成羥*基-TPP，在電子傳遞體（PMS） 存在下，使噻唑藍(lán)（MTT）還原生成藍(lán)色產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)該藍(lán)色產(chǎn)物在 566nm 處的增 加速率，即可得出 PDH 酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 試劑一 液體 100mL×1 瓶 -20℃保存 試劑二 液體 20mL×1 瓶 -20℃保存 試劑三 液體μL×1 支 -20℃保存 試劑四 粉劑 mg×2 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 每支加 0.6mL 的蒸餾水溶解。 試劑五 粉劑 mg×4 支 4℃避光保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 每支加 0.3mL 的蒸餾水溶解。 一天內(nèi)用完。 試劑六 粉劑 mg×2 支 4℃避光保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 每支加 0.6mL 的蒸餾水溶解。 一周內(nèi)用完。 試劑七 液體 16mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、丙酮酸脫氫酶（PDH）活性測(cè)定： 1、線粒體制備（提示：整個(gè)線粒體的提取過(guò)程須保持 4℃低溫環(huán)境）： ① 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞，加入 1mL 試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻 漿，轉(zhuǎn)移至離心管后于 4℃×700g 離心 10min。 ② 棄沉淀，上清液移至另一離心管中，4℃×12000g 離心 10min。用移液器移除上清液(上 清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的酶活性（此步可選做）)，留下沉淀 （沉淀即為線粒體）。 ③ 在沉淀（線粒體）中加入200μL試劑二和2μL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），液體置于冰上用于丙酮酸脫氫酶活性測(cè)定。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取，或按照細(xì) 菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 566nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 10 試劑四 10 試劑五 10 試劑六 10 試劑七 160 混勻，30℃下，10s 時(shí)于 566nm 處讀取吸光值 A1，20min 后讀取吸光值 A2，△A=A2-A1。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘還原 1 nmol 噻唑藍(lán)（MTT）定義為一個(gè)酶活性單位。 PDH 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=107.2×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘還原 1 nmol 噻唑藍(lán)（MTT）定義為一個(gè)酶活性單位。 PDH 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=21.7×ΔA÷W 3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 酶活定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘還原 1 nmol 噻唑藍(lán)（MTT）定義為一個(gè)酶活單位。 PDH 活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.044×ΔA ε---還原型 MTT 的摩爾消光系數(shù)，1.865×104 L/mol/cm； d---96 孔板光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，0.202mL； V1---加入樣本體積，0.01 mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； T---反應(yīng)時(shí)間，20min； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。