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乙酰fu酶A含量試劑盒,微板法

更新時(shí)間:2024-06-20

簡(jiǎn)要描述:

乙酰fu酶A含量試劑盒,微板法
乙酰輔酶 A 是能源物質(zhì)代謝的重要中間代謝產(chǎn)物,在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個(gè)樞 紐性的物質(zhì)。

乙酰fu酶A含量試劑盒,微板法

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本試劑盒僅供科研使用 1 乙酰輔酶 AAcetyl-CoA)含量測(cè)定試劑盒說明書 (貨號(hào):WS6280W 微板法 96 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介: 乙酰輔酶 A 是能源物質(zhì)代謝的重要中間代謝產(chǎn)物,在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個(gè)樞 紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶 A 匯聚成一條共同的代謝 通路--三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化,經(jīng)過這條通路*底氧化生成二氧化碳和水,釋放能 量用以 ATP 的合成。它也是合成脂肪酸、酮體、膽*醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的 前體物質(zhì)。 蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和 NAD+生成草酰乙酸和 NADH。檸檬酸合酶可催化乙 酰輔酶 A 和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶 A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反 應(yīng),乙酰輔酶 A 含量和 NADH 的生成量成正比,340nm 下吸光值的上升量反應(yīng)了乙 酰輔酶 A 含量的高低。 二、試劑盒的組成和配制: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 4℃保存 試劑一 液體 20mL×1 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 -20℃保存 部,再加 用前甩幾下或離心使試劑落入底 9mL 試劑一溶解備用。 試劑三 粉體 mg×1 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部,再加 9mL 試劑一溶解備用。 試劑四 粉體 mg×1 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部,再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品: 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、乙酰輔酶 A 含量測(cè)定: 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)! 1、樣本制備: ① 組織樣本: 稱取約 0.1g 組織樣本,加 1mL 的提取液,進(jìn)行冰浴勻漿,粗提液全部轉(zhuǎn)移到 EP 中,12000rpm4℃離心 10min,上清液待測(cè)。 【注】:若增加樣本量,可按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10 的比例提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本: 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 12000rpm 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。 【注】:若增加樣本量,可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(104):提取液(mL)500~10001 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè): ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min,設(shè)定波長(zhǎng)至 340nm② 試劑解凍至室溫(25℃),在 96 孔板中依次加入:本試劑盒僅供科研使用 2 【注】若ΔA 差值較小如小于 0.005,可增加樣本取樣質(zhì)量 W,如增至 0.2g 或更多,或增 加樣本加樣量 V1(如增至 60μL 或更多,則試劑二和三分別減少 20μL 相應(yīng)減少), 則改變后的 V1 W 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算: 1、按照樣本質(zhì)量計(jì)算: 乙酰輔酶 A 含量(nmol/g 鮮重)=[ΔA÷ε÷d×V2×109]÷(W×V1÷V)=3215×ΔA÷W 2、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算: 乙酰輔酶 A 含量(nmol/104 cell)=[ΔA÷ε÷d×V2×109]÷(500×V1÷V)=6.43×ΔA ε---NADH 摩爾消光系數(shù),6220 L/mol/cmd---96 孔板光徑,0.5cmV---提取液體積,1 mLV1---加入樣本體積,20μL=0.02mLV2---反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4LW---樣品質(zhì)量,g500---細(xì)胞數(shù)量,萬。 試劑名稱(μL測(cè)定管 樣本 20 試劑二 85 試劑三 85 混勻,室溫(25℃)下,5min 后于 340nm 處讀取 A1 值。 試劑四 10 混勻,室溫(25℃)下,反應(yīng) 10min 340nm 處讀取吸光值 A2ΔA=A2-A1

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