更新時間：2019-05-09
PicaGreen dsDNA 定量檢測試劑盒 *2000次*本公司是一家專注于生命科學和生物技術領域的高科技企業(yè)，專業(yè)提供分子生物學、免疫學、生命科學基礎研究以及臨床檢測等諸多領域的試劑、耗材、儀器等各類產(chǎn)品及生物技術服務。
PicaGreen dsDNA 定量檢測試劑盒 *2000次*
PicaGreen dsDNA 定量檢測試劑盒 *2000次*
| 10×100 μL | ￥4,150 |
| 1 mL | ￥3,950 |
操作步驟：
1、試劑制備
PicaGreen dsDNA （Component A ）(定量試劑是以1mL 的濃縮液形式保存在無水的DMSO（二甲基亞砜）中。實驗當天，配制2XPicoGreen 試劑的操作溶液，用1xTE（Component B）按1:200 的比例稀釋濃縮液。如果要準備足夠的操作溶液測定20 個樣品，可在20mL1x TE （Component B）中加入100μLPicaGreen dsDNA（Component A ） 定量試劑。由于試劑容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。PicaGreen 試劑（Component A ）見光易降解，所以應將配好的溶液用錫箔包住或放置暗處避光保存。溶液在配制好數(shù)小時內(nèi)使用，以保證結(jié)果。
2、 DNA 標準曲線
2.1 預備1μg/mLdsDNA（ Component c） 或貯存液于1x TE 中。根據(jù)在1cm 光程長度的比色杯中A260nm 時的吸光度確定DNA 濃度；相應于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。盡管任何純化的dsDNA 制劑都可用來做標準曲線，但常用的是小牛胸腺DNA。用跟被檢測的樣品相似的DNA 做標準曲線，用或長或短的線型DNA 段測定相近大小的酶切片段；質(zhì)粒用于測定質(zhì)粒DNA。然而大部分線狀dsDNA 分子，不管其片段長度大小，都會產(chǎn)生大致相等的信號。PicaGreen 試劑測定法在通常污染核酸制劑的幾種復合物存在的條件下仍能保持線狀，盡管信號強度可能受到影響。因此，為了得到有效的對照處理，被用
來做標準曲線的dsDNA 溶液要用和實驗樣品相同的方式來處理，并且應該包含相同的可能存在的污染物。
2.2 要產(chǎn)生從0.5ng/mL 到500ng/mL（見表1）單重復8 個點的標準曲線，在2X 終濃度下配制一系列的DNA 溶液，混合相同體積的2XDNA 和2XPicaGreen 操作溶液，放入10×10mm 比色杯中。混合相同體積的1XTE 和2XPicaGreen 操作溶液以備空白對照。避光于室溫下放置2-5 分鐘。
2XDNA 溶液濃度 （ng/mL） | 2XDNA 溶液的體積 （mL） | 2XPicaGreen 溶液的 體積（mL） | PicaGreen 試劑測定中DNA 的終濃度(ng/mL) |
1000 | 1 | 1 | 500 |
200 | 1 | 1 | 100 |
50 | 1 | 1 | 25 |
20 | 1 | 1 | 10 |
5 | 1 | 1 | 2.5 |
2 | 1 | 1 | 1 |
1 | 1 | 1 | 0.5 |
0 | 1 | 1 | 空白 |
表1 用10×10mm 比色杯時DNA 標準曲線
2.3 當用微量檢測皿適配器時，PicaGreen 測定也可在較低的測定體積（50μL 到200μL）內(nèi)完成。欲產(chǎn)生從1ng/mL 到100ng/mL（見表2）的標準曲線，在2X 終濃度下配制一系列的DNA 溶液，混合相同體積的2XDNA 和2XPicaGreen 操作溶液，將至少50μL 溶液轉(zhuǎn)移到微量檢測皿中。確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部經(jīng)常可以驅(qū)散氣泡。避光于室溫下放置2-5 分鐘。
2X DNA 溶液濃度 （ng/mL） | 2X DNA 溶液的體積 （uL） | 2X PicaGreen 溶液的體積（uL） | PicaGreen 試劑測定中DNA 的終濃度(ng/mL) |
200 | 30 | 30 | 100 |
50 | 30 | 30 | 25 |
20 | 30 | 30 | 10 |
5 | 30 | 30 | 2.5 |
2 | 30 | 30 | 1 |
0 | 30 | 30 | 空白 |
表2 用微量檢測皿時DNA 標準曲線
2.4孵育后用合適的熒光計測量樣品熒光值。選擇藍色激發(fā)光，用熒光值大的樣品校正儀
器。
2.5 測量剩余樣品的熒光值。不同的微型熒光計將給出一個直接的濃度讀數(shù)，數(shù)據(jù)可以用來產(chǎn)生DNA 濃度的標準曲線，下面以TBS-380 微型熒光計為例。
圖1 PicaGreen 標準曲線
3、樣品分析
3.1 用1X TE 稀釋未知DNA 樣品至需要的體積（10×10mm 比色杯需1.0mL，微量檢測皿需25-100μL）。對樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被大限度地沖淡。然而，也要避免取樣體積太小而無法精確吸取的情況。去除樣品中RNA 和ssDNA 參照4 部分。
3.2 在每個樣品中加入2XPicaGreen 試劑的操作溶液（3.1 節(jié)準備），混合好，將混合物移入合適的比色杯，避光于室溫下放置2-5 分鐘。
3.3 可以對樣品進行不同的稀釋處理重復測定以確保結(jié)果的準確性。
4 去除樣品中單鏈核苷酸
當ssDNA 與dsDNA 等摩爾濃度時，后者的測定受前者的干擾很小。前者濃度10 倍于后者時，。對熒光信號的干擾也不過10%。但當DNA 濃度低時，ssDNA 能產(chǎn)生較大干擾在高濃度時，由RNA 結(jié)合PicaGreen 試劑產(chǎn)生的熒光值用RNA酶處理樣品可消除。RNA 酶A、酶T1 結(jié)合核酸酶S1 能除去所有單鏈核酸，從而保證樣品熒光值是由dsDNA 產(chǎn)生。（具體做法請查閱相關的參考文獻）
參考文獻：
[1] Nucleic Acids Res. 24, 2623 (1996)
[2] BioTechniques 21, 372 (1996)
[3] BioTechniques 21, 664 (1996)
[4] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6091 (1996)
[5] Anal. Biochem. 102, 344 (1980)
[6] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, J. Sambrook, E.F. Fritsch and
T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)
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