ATP含量試劑盒,微板法

ATP含量試劑盒,微板法

ATP含量試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 ATP 含量（磷鉬酸比色法）測(cè)定試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS5180W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 三磷酸腺苷（ATP）是生物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體,是生物體內(nèi)最直接的能量來源， 測(cè)定 ATP 含量并且計(jì)算能荷，能夠反映能量代謝狀態(tài)。 肌酸激酶催化三磷酸腺苷（ATP）和肌酸生成磷酸肌酸，用磷鉬酸比色法進(jìn)行檢測(cè)， 經(jīng)波長掃描產(chǎn)物在 700nm 處有吸收峰，進(jìn)而計(jì)算得到 ATP 的含量。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 提取液A 50mL×1瓶 提取液B 10mL×1瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×2 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉體落入底部，每支再加入 1.1mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。 試劑二 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉劑μg×2 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉體落入底部，每支再加入 0.55mL 蒸餾水溶解待用；用不完的試劑分裝后 -20℃保存，禁止反復(fù)凍融。 試劑四 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用甩幾下使粉劑落入底部，每瓶再依次加入 2.86mL 水混勻，最后加 1.14mL 濃硫酸（加濃 硫酸時(shí)務(wù)必小心，逐滴緩慢加入水中，注意防護(hù)）。 試劑五 液體 40mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)液 粉體 mg×1 支 -20℃保存 用前準(zhǔn)確稱取 2mg 粉體即 ATP 至一新 EP 管中， 再加 1.7mL 蒸餾水溶解即 2μmoL/mL，再用水稀 釋一倍成 1μmoL/mL 標(biāo)準(zhǔn)品，待用(-20℃保存，一 周內(nèi)用完)。 【注】：全程操作需無磷環(huán)境；試劑配置用新的槍頭和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿， 避免磷污染。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、研缽和蒸餾水。 四、ATP 含量檢測(cè)： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織加入研缽中，加 0.5mL 提取液 A 進(jìn)行勻漿，轉(zhuǎn)至 EP 管中，于 12000rpm，室溫離心 10min，取出 250μL 上清液至一新 EP 管中，再加入適量提取液 B 調(diào) PH 至中性（用 PH 試紙測(cè)量，PH 在 6.5-8 之間均可）。再加蒸餾水定容至 0.5mL， 該液體待測(cè)備用。 【注】：也可以按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 細(xì)菌/真菌樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心棄上清；取500萬細(xì)菌或細(xì)胞至研缽中，加0.5mL 提取液 A 進(jìn)行勻漿，低溫超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔本試劑盒僅供科研使用 2 10s，重復(fù) 30 次），于 12000rpm，室溫離心 10min，取出 250μL 上清液至一新 EP 管中， 再加入適量提取液 B 調(diào) PH 至中性（用 PH 試紙測(cè)量，PH 在 6.5-8 之間均可）。再加蒸 餾水定容至 0.5mL，該液體待測(cè)備用。 ③ 液體樣本： 澄清樣本直接檢測(cè)，若渾濁則 12000rpm，4℃離心 5min 后取上清液測(cè)定。 【注】：也可以按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 700nm。 ② 反應(yīng)液配制：按照試劑四：試劑五=1：5 的比例混勻。用多少配多少的混合液。 ③ 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱(μL) 測(cè)定管 對(duì)照管 標(biāo)準(zhǔn)管 （僅做一次） 空白管 （僅做一次） 樣本 20 20 標(biāo)準(zhǔn)液 20 試劑一 20 20 試劑二 50 50 50 50 試劑三 10 10 蒸餾水 30 50 充分混勻，37℃準(zhǔn)確水浴 30min 反應(yīng)液 180 180 180 180 混勻，37℃水浴 20min，液體全部轉(zhuǎn)移至 96 孔板中，在 700nm 下 讀取各管吸光值 A（每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。 【注】若 A 測(cè)定-A 對(duì)照的值小于 0.01，可增加取樣質(zhì)量 W（如增至 0.2g）或增加樣本加 樣量 V1（如由 20μL 增至 50μL，則試劑二相應(yīng)減少）；標(biāo)準(zhǔn)管仍為 20μL，其他試劑不變； 則改變后的 W 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本鮮重計(jì)算： ATP 含量(μmol/g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)×V 標(biāo)×(A 測(cè)定-A 對(duì)照)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)]÷(W×V1÷V) =(A 測(cè)定-A 對(duì)照)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)÷W 2、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算： ATP 含量(nmol/104 cell)=[C 標(biāo)準(zhǔn)×V 標(biāo)×(A 測(cè)定-A 對(duì)照)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)]÷(500×V1÷V)×103 =2×(A 測(cè)定-A 對(duì)照)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白) 3、液體中 ATP 含量計(jì)算： ATP 含量(μmol/mL)=[C 標(biāo)準(zhǔn)×V 標(biāo)×(A 測(cè)定-A 對(duì)照)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)]÷V1 =(A 測(cè)定-A 對(duì)照)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白) C 標(biāo)準(zhǔn)---標(biāo)準(zhǔn)液濃度，1μmol/mL； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL； V 標(biāo)---標(biāo)準(zhǔn)品加樣體積，0.02mL； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，萬。